مطالعه و شناسایی سویه های باکتریایی تولیدکننده کوتیناز

کوتیناز یک آنزیم هیدرولازی است که کوتین را تجزیه می­کند. کوتین گیاهان عالی از ترکیبات پلی­استری هیدروکسی و اپوکسی اسیدچرب تشکیل شده که عمدتا توسط باندهای استری پیوند یافته­اند. اسیدهای چرب کوتین معمولا n-c16 و n-c18 هستند و حاوی یک تا سه گروه هیدروکسیل هستند. کوتین نقش کلیدی درحفاظت از گیاهان در برابر عوامل بیماریزا ایفا می کند و تجزیه­ی آنزیمی آن اولین گام در فرآیند آلودگی بافت گیاهی است. هدف از این پژوهش استخراج کوتین و مقایسه­ی آنها در میوه­های مختلف و غربالگری باکتری­ها و قارچ­های تولید کننده آنزیم کوتیناز و شناسایی گونه آنها با تعیین توالی ناحیه   ۱۶S DNA می­باشد. با توجه به اهمیت آنزیم کوتیناز به ویژه در صنعت، این مطالعه گامی مهم در شناسایی سویه­های بومی تولید کننده آنزیم کوتیناز و استفاده از آنها در صنعت به شمار می­آید. بدین منظور پوست میوه­های مختلف را جمع­آوری و در بافر اگزالات جوشانده و بعد از شست­و­شو در آون خشک شده و آسیاب گردید. از پودر حاصل به روش کلرفرم متانول کوتین آن جداسازی شد. نتایج نشان می­داد که درصد کوتین استخراج شده در سیب بیشتر است و احتمالا سیب نسبت به آفات و بیماری­ها مقاوم­تر است. در مرحله­ی بعد جداسازی سویه­ای تولیدکننده آنزیم از نمونه­های مختلف انجام شد. نمونه­ها به داخل پلیت های حاوی محیط کشتی که کوتین تنها منبع کربن است تلقیح داده و سویه­های غربالگری شده و به کمک سوبسترای اختصاصی پارانیتروفنول بوتیرات فعالیت کوتینازی سنجیده شد. به منظور بررسی تنوع ژنتیکی ۶ سویه جداسازی شده با استفاده از نشانگر RAPD مورد مطالعه قرار گرفتند. به این منظورDNA ژنومی از سویه­های تولیدکننده آنزم کوتیناز به روش جوشاندن، CTAB و کیت استخراج شد و واکنش PCR با استفاده از ۹ آغازگر  RAPD انجام گردید. برای شناسایی و توالی یابی سویه­ها با استفاده از rDNA 16S  عمل PCR  با دو پرایمر ۸F و  ۱۵۴۱Rانجام شد سپس محصولات PCR برای توالی یابی ارسال شد. این مطالعات نشان می­دهد که سویه­های جداسازی شده دارای فعالیت کوتینازی مناسبی بوده و میزان بالایی از آنزیم کوتیناز را تولید می­کنند که قابلیت مصارف تجاری صنعتی دارند.